臨床ELISA測定溫育這一步是臨床ELISA測定中zui容易出現問題的步驟，所以有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以知足測定要求。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。使用微量加樣器加樣必需留意的樞紐點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產氣憤泡。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要留意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。
溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為樞紐的一個因素。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要留意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很輕易泛起重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區泛起非特異吸附，從而引起非特異顯色。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值泛起：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式開釋，因此，在測定此類激素時，有必要在緊密親密相連的時間距離內采取數份血樣本，以其中間值為測定值。因此在ELISA測定中試劑的預備zui為樞紐的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。加血清樣本及反應試劑在現在的ELISA試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。
臨床ELISA測定現通常為采用手工操縱的以微孔板條為固相的測定模式，測定操縱非常簡樸，一般涉及到標本的收集保留、試劑預備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判定和結果講演及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。濺出會對臨近孔產生污染。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相長進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合，必需在一定的溫度前提下反應一定的時間。
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